카드뮴과 미생물 분석을 통한 식물이 흡연장 환경에 미치는 영향조사
Investigation of Environmental Effect of Plants in Smoking Area through Analysis of Cadmium and Microorganisms
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Abstract
목적
본 연구에서는 공공 흡연장의 식물이 흡연장 주변 환경에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 이를 위하여 식물이 존재하는 흡연장과 식물이 존재하지 않은 흡연장을 각각 선택하고, 흡연자의 수와 침 뱉는 수를 확인하였으며, 각 흡연장의 토양 및 식물 시료 (가능한 경우)를 채취하여 카드뮴의 농도와 토양 미생물의 분포를 확인하였다. 이 연구를 통하여 흡연장에서의 식물의 역할을 확인하고, 향후 식물 식재를 통한 흡연장의 공중위생과 환경개선 방향을 제시하고자 하였다.
방법
식물이 존재하는 흡연장과 식물이 존재하지 않는 흡연장을 각각 1곳 선택하여, 일정 기간 동안의 흡연자 수와 침 뱉는 횟수를 측정하였다. 또한 식물이 존재하는 흡연장의 경우, 식물 잎 부분과 식물 주변 표층 및 근권부 토양을 채취하여 ICP-MS를 이용한 카드뮴 농도를 분석하였다. 식물이 없는 흡연장의 경우, 표층 토양시료를 분석에 사용하였다. 또한 각 토양 시료에 대한 denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)와, 16s rRNA amplicon sequencing을 이용한 metagenomics분석을 통하여 시료에 존재하는 미생물의 genus 수준 분석을 진행하였다.
결과 및 토의
식물이 있는 흡연장의 경우 흡연자 수가 시간 당 (2개월간, 11:30~12:30 사이)에 176.67±7.84 명, 918.67±40.8 회 흡연 중 침을 뱉는 것으로 확인되었다. 식물이 없는 흡연장의 경우, 흡연자 수가 시간 당 (2개월간, 11:30~12:30 사이)에 153.67±5.44 명, 총 829.8±29.36 회 흡연 중 침을 뱉는 것으로 확인되었다. 식물이 존재하는 흡연장의 경우, 식물 잎에서 가장 높은 카드뮴 농도가 (347.117±24.542 μg/kg) 확인되고 있으며, 식물 근권부, 표층토양, 순으로 나타났다. 반면, 식물이 존재하지 않는 흡연장에서는 표층토에서 식물 존재 흡연장의 식물 잎과 유사한 농도의 카드뮴 (295.77±16.64 μg/kg)이 확인되었다. 이상의 결과는 흡연 중 담뱃재, 침, 연기 등으로 방출되는 카드뮴이 식물체와 토양에 축적될 수 있으며, 식물의 존재에 따라 주변 토양에 대한 축적 및 주변 대기환경에 대한 방출을 식물내의 축적으로 유도할 수 있음을 나타낸다. 각 시료의 미생물 분석 결과를 통하여 확인한 결과, 흡연 중 침 뱉는 행위 및 담뱃재 및 꽁초의 투척이 주변 토양 및 근권부 미생물 분포에 영향을 주고 있으며, 분석된 토양내의 미생물은 카드뮴 등의 중금속의 독성제거에 중요한 역할을 하는 종류로 확인되고 있다.
결론
공공 흡연장에서, 식물의 존재에 따라, 흡연 중 독성 물질로서 방출되는 카드뮴의 토양 및 식물 내의 농도가 큰 차이가 남을 알 수 있었다. 또한 식물의 존재에 따라 토양에 존재하는 미생물의 종류와 그 역할도 큰 차이가 남을 확인할 수 있었다. 이는 흡연장의 식물의 존재가 카드뮴의 주변 환경에 대한 확산을 제어할 수 있는 방법임을 보여주고 있으며, 흡연장에서의 다양한 식물 식재가 흡연장 환경 개선 및 주변 비흡연자의 생활 환경 유지에 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 알려주고 있다.
Trans Abstract
Objectives
The purpose of this study was to investigate the effect of plants on smoking area and its environment. For this purpose, two different smoking areas (with and without plants) were selected, and the number of smokers and spitting behaviors were monitored. Soil and leaves samples of each smoking area were taken to analyze the concentration of cadmium and distribution of soil microorganisms. Through this investigation, the role of plants in smoking area for the cadmium and microorganisms was estimated.
Methods
In the selected smoking areas, number of smokers and the number of spitting behaviors were monitored. Cadmium (Cd) concentrations of leaves, topsoil and rhizosphere obtained from the smoking areas were analyzed with inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS). The microorganisms in soil samples were analyzed using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and 16s rRNA amplicon sequencing based metagenomics.
Results and Discussion
In the case of smoking area with plants, number of smokers and number of total spitting behaviors were 176.67 ± 7.85 and 918.67 ± 40.8 times per hour, respectively. In smoking area without plants, the 153.67 ± 5.44 (smokers) and (829.8 ± 29.36 (spitting behavior) per hour were observed. Among the collected samples from the smoking areas, the highest Cd values (347.117 ± 24.542 μg/kg) were found in leaves of smoking area. In the case of smoking area without plants, the top soil samples showed the highest Cd concentration (295.77 ± 16.64 μg/kg). The results indicate that Cd released from cigarette ash, saliva and smoke can be accumulated in plants and soil. The results suggested that the presence of plants in the smoking area protect the accumulation of Cd in surrounding environments (soil and atmosphere). The metagenomic analysis of the soil samples showed that smoking and spitting behavior also affected microbial system in the smoking areas. The results showed that the microorganisms in smoking area were closely related to the heavy metal removing activities.
Conclusion
Results suggested that the cadmium distribution in the smoking areas was significantly affected by the presence of live plants. In addition, the presence of plants in the smoking area induced the difference species microorganisms. These results suggested that the presence of plants in smoking area can protect the spread of cadmium to the surrounding environment.
1. 서 론
2020년 보건복지부에서 발표한 국민건강영양조사에 따르면, 2020년 기준으로 우리나라 사람들 중 남자는 34.0%, 여자는 6.6%가 흡연을 하는 것으로 나타났다[1]. 또한 우리나라의 금연구역은 지난 1995년 국민건강증진법 이후로 생겨난 후 2003년 4월 금연구역이 대폭 확대되었고 그 이후로 점차 늘어나는 추세이다[2]. 서울특별시 광진구 기준으로 금연구역은 2,663개소로 나타나는 것에 반해, 흡연구역은 이에 현저히 못 미치는 41개소에 불과한 상황으로 조사되고 있다[3,4]. 연구에 따르면, 흡연장 주변을 지나가는 사람들 중 80%가 흡연자이며, 이들 중 67%는 흡연 중 침을 뱉는 것으로 나타났으며[5], 이 침 뱉는 행위는 흡연 중 타액 분비량의 증가에 기인하는 것으로 보고되고 있다[6]. 따라서 흡연 중 침을 뱉는 행위로 인하여, 침 속의 다양한 미생물이 흡연장 유동인구로 인하여, 주변으로 광범위하게 확산되고, 다양한 미생물 감염을 유발할 수 있다[5]. 또한 흡연자의 침에는 담배의 연소 과정에서 발생하는 각종 독성물질이 용해되어 침과 함께 배출될 수 있다[7]. 예를 들어, 흡연 시 발생하는 담배 연기 속에는 약 5,000종 이상의 독성 물질이 포함되어 있으며, 이는 일산화탄소, 타르, 니코틴, 카드뮴 등 다양한 물질로 구성되어 있다[8]. 특히 카드뮴의 인체 노출의 주요 원인은 담배 연기인 것으로 연구된 바 있다[9]. 또한 흡연 후 발생하는 담뱃재에서 담배 전체의 카드뮴 농도 대비 약 10% 잔존하고 있다는 보고가 존재한다[10]. 따라서 흡연 시, 뱉는 침에는 상기 각종 독성물질이 높은 농도로 존재하며, 이는 흡연자 및 주변 비흡연자의 건강과 생활 환경에 나쁜 영향을 미칠 수 있다.
담배연기 및 담뱃재에 포함되어 있는 카드뮴은 세계보건기구(WHO)에서 규정한 10대 유해화학물질에 포함되어 있으며, 유럽연합 (EU)에서는 카드뮴을 포함한 6종 유해물질이 전기전제자품에서 사용하는 것을 제한하고 있다[11]. 카드뮴은 인체 내에서 소량만으로 독성을 나타내며, 체내에서 쉽게 축적되고, 장시간 배출되지 않으면서 인체에 다양한 중독을 일으키는 것으로 알려져 있다. 특히 카드뮴은 간, 위장, 중추신경계의 급성 중독현상과, 칼슘 흡수 장애 및 신장기능의 장애 등 만성중독증을 일으키는 원인 중 하나로 보고된 바 있다[12]. 한 연구에 따르면 내당장애가 없는 18-30세 사이의 흡연자 1,386명, 과거흡연자 621명, 흡연 무경험자 1,452명을 15년간 내당 장애 발생률을 추적하여 조사한 결과, 담배연기에 노출되지 않은 비흡연자의 경우 11.5%의 내당장애 발생률을 보인 반면, 간접흡연을 한 비흡연자와 흡연자가 각각 17.2%와 21.8%의 내당장애 발생률을 보인 바 있다[13]. 폐암발생 위험도의 경우 간접흡연에 노출된 남성의 경우 1.48배, 간접흡연에 노출된 여성의 경우 1.2배 높은 것으로 보고된 바 있으며, 만성폐쇄성 폐질병에서는 간접흡연에 노출된 남성의 경우 1.27배, 간접흡연에 노출된 여성의 경우 1.13배 높은 것으로 나타난 연구가 존재한다[14,15]. 따라서 흡연장에서 흡연 중 발생하는 카드뮴이 공기 중으로 확산된다면, 흡연자 및 비흡연자의 개인 건강은 물론 각종 공중보건 관련 문제가 심각하게 발생할 가능성이 존재한다. 따라서 흡연장 속 카드뮴 공기 중으로 확산되는 것을 방지할 필요가 있는 상황이다.
공기 중 카드뮴 확산 방지 현상 중 하나로, 도심 대기 중의 부유 중금속이 가로수에 흡착이 되는 현상이 여러 논문에서 보고되었다[16,17,18]. 이는 식물이 카드뮴을 포함한 다양한 중금속을 다양한 대사과정을 통해 흡착 및 흡수하는 것으로 이루어지는 것으로 보인다. 중금속을 함유한 공기 중 부유입자의 흡착 및 흡수 방법으로 알려진 것 중 하나는, 식물의 잎에 존재하는 왁스층에서 흡착이 된 후 식물 내로 축적된다고 알려져 있다[19]. 또한 잎 표면을 통한 중금속의 흡수의 경우, 기공, 큐티클 층에 존재하는 균열, 피목, 수성 기공 및 미세통로(ectodesmata)등 다양한 매개체를 통해 발생할 수 있는 것으로 확인되고 있다[20]. 또한 식물은 잎 외에도 근권부에서 토양 내 중금속을 식물의 뿌리로 흡수할 수 있다고 연구된 바 있으며[21], 이때 뿌리를 통해 흡수된 중금속은 식물 체내의 물관부(xylem)을 통해 식물 내에서 축적되는 것으로 보고되고 있다[22]. 이와 같이 식물은 공기 중의 중금속의 확산을 방지할 수 있으며, 토양 내에 존재하는 중금속을 식물 체내로 흡수하여 토양 내 중금속 오염을 방지할 수 있는 역할을 한다고 판단된다.
식물의 자체적인 카드뮴 제거 현상 외에도, 식물 근권부에 존재하는 다양한 토양 미생물이 중금속 정화에 효과적인 것으로 연구되었다. 예를 들어 Pseudomonas aeruginosa는 카드뮴, 납, 구리 등의 중금속을 효율적으로 흡착 및 제거할 수 있다고 보고되었다[23]. 특히 토양 미생물 중 sulfate reducing bacteria (SRB)는 bioremediation을 통해 카드뮴을 포함한 다양한 중금속을 제거할 수 있다는 연구 결과가 존재한다[24]. 이와 같은 근권부 미생물들은 토양 속 유기 오염 물질을 분해하여 식물을 보호하고, 식물 생장에 도움이 되는 영양분을 제공하여 식물 생장을 촉진할 수 있다. 또한 식물의 뿌리에서 나오는 삼출물(exudate)은 미생물 생육에 도움을 되는 것으로 확인되고 있다[25,26]. 따라서 식물에 의한 중금속 흡착 및 흡수는 식물 대사 과정에 의한 영향을 받으며, 관련된 근권부 미생물도 중요한 역할을 할 것으로 판단된다.
따라서 본 연구에서는 식물이 존재하는 흡연장과 식물이 존재하지 않는 흡연장의 토양, 식물 등의 시료를 채취하여, 중요 유해물질인 카드뮴의 분포를 확인하고, 주변의 식물이 카드뮴의 분포에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 국내 종합대학 내, 식물이 존재하는 1개소의 흡연장, 식물이 존재하지 않는 1개소의 흡연장 그리고 1개소의 비흡연구역에서 근권부, 표층토 그리고 식물 잎에서의 카드뮴 농도를 분석하였다. 또한 실험을 진행한 흡연장 및 비흡연구역의 특성을 파악하기 위하여 유동인구, 흡연자 수 및 침 뱉는 횟수를 측정하였다. 이와 함께, 흡연장에서 흡연 행위에 따른 식물의 중금속 흡착 및 흡수와 근권부 미생물 간의 관계를 분석하기 위하여 DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)를 진행하였으며, 추가적으로 배양 불가능한 미생물의 균주 조성을 분석하기 위해 16s rRNA amplicon sequencing을 기반으로 하는 metagenomics 분석을 진행하였다. 이를 통하여, 식물의 존재가 흡연장에서 카드뮴 분포에 어떤 영향을 미치는지 확인하고, 흡연이 주변 토양 미생물의 분포에 미치는 영향 또한 확인하고자 하였다.
2. 실험방법(또는 재료 및 방법)
2.1. 흡연장 및 비흡연구역의 특성 분석
본 연구를 진행하기 위하여 대한민국 서울시 소재 종합대학 내 2 곳의 흡연장(A, B)과 1 곳의 비흡연구역(C) (흡연장 A: 37°32'30.96"N, 127°04'27.77"E, 흡연장 B: 37°32'29.76"N, 127°04'32.0196"E, 비흡연구역 C: 37°32'33.35"N, 127°04'26. 84"E)을 선정하였다. 흡연장 A는 2종의 식물(Chionanthus retusus(이팝나무), Ginkgo blioba(은행나무))이 식재되어 있는 흡연장이며, 흡연장 B는 식물이 존재하지 않는 흡연장으로 설정하였다. 비흡연구역 C는 3종의 식물(Chionanthus retusus (이팝나무), Ginkgo blioba(은행나무), Acer palmatum(단풍나무)이 식재되어 있는 곳으로 선정하였다. Fig. 1에 흡연장 A와 B를 구성도로 표시하였다. 각각의 해당 흡연장과 비흡연구역의 면적, 수목의 개수 및 종류의 분석은 3명의 실험자(A, B, C)가 진행하였다. 실험자 중 A, B는 각각 흡연장과 비흡연구역의 면적을 가로 세로 길이를 측정하여 산출하였다. 실험자 C는 흡연장과 비흡연구역에 존재하는 식물의 수종을 스마트렌즈 프로그램(Smart Lens, NAVER, Korea)를 이용하여 확인하였다. 흡연장에서 시간 당 흡연자 수 및 침 뱉는 횟수 분석은 4명의 관찰자(D, E, F, G)가 육안으로 진행하였다[5]. 관찰자 (D, E)는 흡연장으로부터 50 m 떨어진 위치에서 시간당 흡연자의 수를 기록하였고, 관찰자(F, G)는 흡연자가 침 뱉는 횟수를 기록하였다. 측정 기간 및 측정 시간대는 11:30~12:30에 1주에 1일, 8주간에 걸쳐 총 8회 진행하였으며, 카드뮴 및 미생물 분석은 실험자(H, I, J, K)가 해당 일자에 흡연장과 비흡연구역에서 동일 시료를 3회 이상 측정하여 결과를 산출하였다, 수치분석은 실험자(L, M)이 통계 프로그램인 SPSS (Ver. 25)으로 진행하였다.
The schematic illustration of the smoking area for the experiment: (A) Smoking area A with plants at 37°32'30.96"N, 127°04'27.77"E, (B) Smoking area B without plants at 37°32'29.76"N, 127°04'32.0196"E.
2.2. 시료의 채취
홉연장 A, B 그리고 비흡연구역 C에서의 토양 및 잎 시료를 채취하여 카드뮴 농도 분석과 근권부 미생물 평가 분석에 사용하였다. 토양 및 잎 시료의 채취 방법은 Fig. 2에 표시하였다.
The schematic illustration of the sampling method for cadmium analysis. Rhizosphere and topsoil samples were collected using a soil sampler, and leaves samples were obtained from plants.
식물이 있는 흡연장 A와 비흡연구역 C에서 근권부 토양 (rhizosphere)와 표층부 토양 (topsoil)과 식물이 없는 흡연장 B에서의 표층부 토양을 채취하기 위하여 soil sampler (diameter: 21mm, length: 100mm)를 사용하였다. 근권부와 표층부의 토양의 경우, 30 g 채취 후 dry oven에서 60℃에서 24 h 건조한 후 카드뮴 농도 분석에 사용하였고, Chionanthus retusus (이팝나무)의 잎의 경우 30 g을 채취한 후 dry oven에서 60℃에서 72 h 건조한 후 카드뮴 농도 분석에 사용하였다. 식물이 있는 흡연장 A와 비흡연구역 C에서의 근권부 분석을 위해 근권부 토양 50g을 채취하여 DGGE와 16s rRNA amplicon sequencing 분석에 사용하였다.
2.3. 카드뮴 농도 측정
카드뮴 농도 분석용 근권부(흙 및 뿌리), 표층토, 그리고 잎 시료를 흡연장 및 비흡연구역 주변에서 2.2에서 언급한 방식으로 채취하였다. 토양 시료의 조제는 토양오염 공정시험기준에 준하여 진행하였다[27]. 시료를 30 g 채취 후 dry oven에서 60℃에서 24 h 건조하여 건조 중량 기준 15 g의 토양 시료를 얻었다. 건조된 토양 시료를 막자사발과 막자를 이용하여 분쇄 후 150 µm sieve로 체 거름하여 조제하였다. 잎 시료는 흡연장 및 비흡연구역에서 채취한 잎을 60℃에서 72 h 건조하였다. 건조된 잎 시료를 막자사발과 막자를 이용하여 최대한 분쇄하여 15 g의 잎 분말 시료를 조제하였다. 해당 분석용 근권부, 표층토 그리고 잎 시료는 서울 소재 한양대학교 서울공동기기원(Korea)에 의뢰하여 ICP-MS (iCAP RQ, Thermo Fisher Scientific, USA)로 분석하였다. 결과 통계 분석은 통계 프로그램인 SPSS (Ver. 25)를 사용하여 구하였다.
2.4. DGGE 미생물 분석
흡연장 및 비흡연구역의 토양 시료의 DNA를 DNA extraction kit (FastDNA Spin Kit for Soil, MP Biomedicals, USA)를 사용하여 추출하였다. 추출된 DNA의 증폭을 위해 두 가지 primer를 사용하여 1차 PCR (polymerase chain reaction)을 진행하였다: E27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'), 1542R(5'-AGA AAG GAG GTG ATC CAG CC-3'). 1차 PCR은 Thermal cycler (Hush RunTM Thermal Cycler, Biofact, Korea)를 사용하여 95℃에서 20 sec (denaturation), 62℃에서 40 sec (annealing), 72℃에서 120 sec (polymerization)를 30 cycle을 반복하는 조건으로 진행하였다. 1차 PCR 산물은 EtBr (Ethidium bromide, Sigma, USA)로 염색한 1% agarose gel (Agarose, Medicago, Sweden)상에서 전기영동하여, UV transilluminator (MUV26-312, Major science, USA)를 이용해 밴드를 관찰하였다. 1차 PCR산물로 2차 PCR을 수행하였으며, primer는 E341F-GC(5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3)와 786R(5’-CGA CCA GGG TAT CTA ATC-3’)을 이용하였다. 2차 PCR은 1차 PCR에서 사용한 thermal cycler를 사용하여 진행하였으며, PCR 조건은 95℃에서 20 sec(denaturation), 65℃-55℃(-0.5℃/cycle)에서 40 sec(annealing), 72℃에서 60 sec(polymerization)를 20 cycle을 반복한 후, 95℃에서 20 sec(denaturation), 55℃에서 40 sec(annealing), 72℃에서 60 sec(polymerization)를 15 cycle 반복하는 조건으로 진행하였다. 2차 PCR 산물을 1차 PCR 과정과 동일하게, 1% agarose gel에서 전기영동하여 밴드를 관찰하였다. 2차 PCR 증폭 산물은 denaturing gradient gel상에서 DGGE를 진행하였다. Denaturing gradient gel은 10% polyacrylamide (37.5:1 acrylamide:bisacrylamide)를 포함하며, urea (Urea, Sigma, USA)와 formamide (Formamide, Sigma, USA) 변성제를 사용하여 40-70% 농도구배를 형성하였다. 50X TAE (50X TAE, Biosesang, Korea)를 1차 증류수로 50배 희석한 1X TAE 23L에서 60℃, 110V로 20시간 동안 전기영동 하였다. 20시간 후, EtBr로 염색한 gel을 UV transilluminator로 밴드를 관찰하였다[28].
2.6. Next generation sequencing (metagenomics) 분석
흡연장 및 비흡연구역의 토양 시료의 16S rRNA gene의 variable region 염기서열 분석을 통해 시료 중 미생물 군집의 종류의 비교를 위해 16S rRNA amplicon sequencing (metagenomics) 분석을 진행하였다. 흡연장 및 비흡연구역의 토양 시료를 대한민국 안양 소재 ㈜세니젠(Korea)에 의뢰하여 분석하였다. 미생물 종류의 분석은 sequencing, quality control, denoising process 그리고 taxonomy classification의 과정을 통해 진행되었다. Sequencing 과정에서, 16s rRNA V3-V4 region을 PCR과정을 통해 증폭하였고, Nextera XT library prep kit (Nextera XT DNA Library Preparation Kit, Illuminam, USA)를 이용하여 라이브러리를 제작하였으며, MiSeq (MiSeq system, Illumina, USA)로 2×300bp paired end로 sequencing을 진행하였다[29]. Quality control은 FastQC (v.0.11.9)로 sequencing quality와 overrepresented sequences를 확인하였다. 그 이후 denoising 과정에서 adaptor, index 등의 artificial sequence를 제거하고, read 말단의 low quality 부분을 잘라낸 후, noise를 수정 및 제거하였다. 최종적으로 남은 신뢰할 수 있는 고품질의 forward read와 reverse read를 이어 붙여 하나의 긴 read로 만들고, 복수의 16s rRNA gene으로부터 증폭되어 발생한 chimeric sequence를 제거하였으며, sequencing 과정에서 유입되는 chloroplast 및 mitochondria 유래 read를 제거하였다[30]. 그 다음 SILVA 138 ribosomal rRNA database를 참조하여 taxonomic sequence classification을 확인하였으며, top 10 bar plot으로 미생물 분포를 시각화 하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1. 흡연장 및 비흡연구역의 특성과 흡연자 수 및 침 뱉는 횟수 분석
식물이 있는 흡연장 (A)의 넓이는 134.78m2였으며, 총 식물 개수가 15 개 심어져 있었으며, 식물은 수목으로서, Chionanthus retusus(이팝나무), Ginkgo blioba(은행나무)가 각각 10, 5개 존재하였다. 식물이 있는 흡연장에서의 흡연자 수는 (2022년 9-10월 동안 11:30-12:30 사이에 측정하였으며, 측정 결과 176.67 ± 7.84명으로 나타났다. 이때 흡연자 1인당 5.2 ± 3.19 번 침을 뱉는 것으로 확인되었다. 식물이 없는 흡연장(B)의 넓이는 203.05 m2 였으며, 흡연자 수는, 식물이 있는 흡연장과 동일한 기간에 153.67±5.44명이었고 흡연자 1인당 5.4 ± 3.61 번 침을 뱉는 것으로 확인되었다. 흡연자 수의 경우, 식물이 있는 흡연장 A의 흡연자 수가 식물이 없는 흡연장 B에 비해 시간 당 약 23 명 더 높게 확인되었다. 이는 흡연장 A의 경우 도서관이 위치해 있고, 흡연장 특성 분석 일자가 교내 시험 기간 중이었다는 점에서 흡연장 A의 유동인구가 흡연장 B 보다 더 높은 것으로 보인다. 흡연자 1인당 침을 뱉는 횟수는 흡연장 A와 B에서 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나 총 침 뱉는 횟수는 식물이 있는 흡연장 A의 침 뱉는 수(918.67 ± 40.8 회)가 식물이 없는 흡연장 B (829.8 ± 29.36 회)에 비해 약 89 회 더 높게 확인되었다. 이는 총 흡연자 수와 비례하고 있음을 나타내는 결과이다. 흡연장 A와 흡연장 B에서의 흡연자 수와 흡연자 1인당 침을 뱉는 횟수 및 총 침을 뱉는 횟수를 Fig. 3에 나타내었다.
Numbers of smokers, the number of spitting behaviors per person and total number of spitting in the smoking areas: (A) Smoking area A with plants at 37°32'30.96"N, 127°04'27.77"E, (B) Smoking area B without plants at 37°32'29.76"N, 127°04'32.0196"E.
3.2. 흡연장 및 비흡연구역 주변 식물 근권부, 표층토, 잎에서의 카드뮴 농도 분석
흡연장 A, B와 비흡연구역 C의 근권부, 표층토 그리고 잎에서의 카드뮴 농도 분석 결과를 Fig. 4에 표시하였다. 카드뮴 분석을 위한 잎 시료는 Chionanthus retusus(이팝나무)로부터 채취하여 카드뮴 분석을 진행하였다. 흡연장 A, B 그리고 비흡연구역 C의 토양 재질은 육안으로 확인하여 동일한 구성을 가진 부분에서 채취하여, 분석을 진행하였다. 흡연장 B의 경우, 식물이 존재하지 않아서 근권부와 잎에서의 카드뮴 농도 결과를 분석하지 않았다.
Cadmium concentration in the smoking areas A, B and non-smoking area C. Different superscript letters indicate significant difference (p<0.05).
식물이 있는 흡연장 A의 경우, 근권부에서 카드뮴 농도가 95.57 ± 16.97 µg/kg, 표층토에서는 87.53 ± 5.68 µg/kg, 잎에서는 347.117 ± 24.542 µg/kg으로 측정되었다. 식물이 없는 흡연장 B의 경우, 표층토에서 카드뮴 농도가 295.77 ± 16.64 µg/kg으로 측정되었다. 식물이 있는 비흡연구역 C의 경우, 근권부에서 카드뮴 농도가 148.96 ± 47.83 µg/kg, 표층토에서는 91.14 ± 6.17 µg/kg, 잎에서는 26.14 ± 8.40 µg/kg으로 확인되었다. 식물이 있는 흡연장 A, 식물이 없는 흡연장 B 그리고 식물이 있는 비흡연구역 C의 표층토에서의 카드뮴 농도가 유의미하게 차이가 났으며, 식물이 없는 흡연장 B의 표층토 속 카드뮴 농도가 식물이 있는 흡연장 A와 비흡연구역 C의 표층토에서의 카드뮴 농도 보다 각각 239.76 ± 33.02%, 226.30 ± 33.02% 높게 확인되었다.
이상의 결과에서 식물이 있는 흡연장 A, 식물이 없는 흡연장 B의 표층토에서 카드뮴 농도가 크게 차이가 나는 이유는, 토양에 직접적으로 뿌려지는 담뱃재, 담배꽁초 그리고 침 뱉는 행위로 인하여 발생한 카드뮴과 담배연기를 통해 발생한 공기 중 카드뮴의 식물에 인한 흡수 또는 흡착이 주요한 원인이라고 판단된다. 알려진 바와 같이, 식물은 식물내부로 뿌리를 통한 흡수와 잎을 통한 흡착을 통하여 카드뮴과 같은 유해물질을 외부 환경으로부터 이동시키는 작용을 할 수 있고, 식물에 의하여 활성화된 근권부 미생물 또한 자체적으로 주변의 카드뮴을 흡착 및 용해도 감소를 유도할 수 있다는 기존의 연구 결과와 잘 부합된다[21,22,23,24]. 동일한 이유로서, 흡연 중 뱉는 침 속 존재하는 카드뮴이 표층토로 직접 전달되는, 식물이 없는 흡연장 B의 표층토의 경우, 가장 높은 카드뮴 농도가 관찰되었으며, 이는 담뱃재, 담배꽁초 그리고 침 뱉는 행위로 인하여 발생하는 카드뮴의 식물로 인한 흡수가 불가능하며, 식물의 존재에 따라 활성화되는 관련 미생물의 비활성화가 그 증가된 원인이라고 판단된다[31].
식물이 있는 흡연장 A와 식물이 있는 비흡연구역 C의 잎에서의 카드뮴 농도가 유의미하게 차이가 났으며, 흡연장 A의 잎 속 카드뮴 농도가 비흡연구역에 비해 1382.51 ± 498.13% 높게 확인되었다. 식물이 있는 흡연장 A, 식물이 있는 비흡연구역 C의 잎에서 카드뮴의 농도가 크게 차이나는 가능한 이유는, 담배연기의 카드뮴이 나뭇잎의 왁스층을 통한 흡착과, 기공, 큐티클 층에 존재하는 균열, 피목, ectodesmata 등을 통한 흡수와, 뿌리를 통해 흡수한 중금속이 물관부를 통해 식물 체내로 이동하여 식물의 잎까지 이동할 수 있기 때문으로 보인다[8,9,10,12,19,20,21,22]. 이에 반해 식물이 있는 흡연장 A와 식물이 있는 비흡연구역 C의 표층토와 근권부에서의 카드뮴 농도는 크게 차이가 나지 않는 것으로 확인되었다. 이는 카드뮴을 포함한 중금속에 내성을 가지며, 이러한 중금속을 불용화 하거나, bioremediation 과정을 통해 제거할 수 있는 미생물들이 표층토와 근권부에 다량 존재하는 것이 카드뮴 농도가 유의미하게 차이를 보이지 않도록 한 중요한 원인 중 하나라고 판단된다[23,24].
이상의 결과를 통하여, 흡연장에 존재하는 식물은 적극적으로 흡연 중 발생하는 카드뮴 등의 각종 독성물질을 식물의 잎 그리고 뿌리에 흡수 혹은 흡착하는 것으로 판단된다. 따라서 식물을 흡연장에 식재를 하면 흡연장 외부 환경으로 카드뮴이 확산되는 것을 방지할 수 있을 것으로 판단된다.
3.2. DGGE 방법을 이용한 흡연장 및 비흡연구역 주변 근권부 토양의 미생물 군집 분석
식물의 존재가 근권부 토양에서의 미생물 군집에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 식물이 있는 흡연장 A 그리고 식물이 있는 비흡연구연 C의 근권부 시료를 사용하여 DGGE를 진행하였다. DGGE 방법은 일반적인 고체배지에서 배양이 불가능한 미생물의 분포 확인이 가능한 방법이다[32]. 분석 결과는 Fig. 5와 같이 나타났다.
DGGE fingerprints of the rhizosphere samples in the smoking area and non-smoking area: (A) smoking area A with plants (B) non-smoking area with plants. The arrows indicate the major distinctive bands of each sample.
흡연장 A 그리고 비흡연구역 C에서 다양한 미생물 분포가 확인되었다. 동일한 위치에서 나타난 밴드도 존재하지만, 흡연장과 비흡연장에서의 식물의 유무와, 흡연 유무, 유동인구 수, 침 뱉는 행위를 포함하는 다양한 환경적인 요인에 따른 독자적인 DNA line을 확인하였다. DGGE 상에서 다양한 DNA band가 확인되었다는 것은 해당 시료에 서로 다른 다양한 세균 또는 아종 (substrain)이 존재함을 의미한다[32] 흡연장 A와 비흡연구역 C 모두 20개 이상의 DNA band가 DGGE 상에서 나타났다. 이를 통해 흡연장 A와 비흡연구역 C의 근권부에는 다양한 미생물이 분포하고 있으며, 흡연의 유무, 침 뱉는 행위, 흡연장과 비흡연구역에서의 증가된 유동인구 수 등 다양한 원인에 따라 근권부 미생물 분포에 영향을 줄 수 있다고 판단된다. 이 결과를 더욱 자세히 분석하기 위하여, 식물이 있는 흡연장 A 그리고 식물이 있는 비흡연구연 C의 근권부 시료를 16s rRNA amplicon sequencing을 이용한 metagenomic analysis를 적용하였다.
3.3 16s rRNA amplicon sequencing 방법을 이용한 흡연장 및 비흡연구역 주변 근권부의 미생물의 군유전체학 (metagenomics)분석
식물이 있는 흡연장 A, 그리고 식물이 있는 비흡연구연 C의 근권부 시료 중 미생물 군집의 종류를 metagenomic analysis를 사용하여 분석하였다. 속 (Genus) 수준에서 미생물 군집의 비율을 분석한 결과는 Fig. 6에 표시하였다. 속 수준에서 분석한 결과 흡연장 A의 경우 Candidatus Udaeobacter, Vicinamibacteraceae, Sphingomonas의 순서로 우세한 것으로 나타났으며, 비흡연구역 C의 경우 uncultured Vicinamibacterales, Candidatus Udaeobacter, Nitrospira의 순서로 우세한 것으로 분석되었다. 흡연장 A에서 가장 우세하게 나타난 Candidatus Udeobacter는 Zn, Cd, Ni 그리고 Cu가 존재하는 폐 구리 광산 (copper mine) 근처 흙에서 가장 지배적으로 나타나는 속(genus)으로, 카드뮴에 대한 tolerance process에 관련이 있는 것으로 연구된 바 있다[33,34]. Vicinamibacteraceae, Flavobacterium, WD2101 soil group, Flavisolibacter 그리고 Nocardioides는 흡연장 A에서만 발견되었으며, Nitrospira, uncultured Planctomycetales, uncultured Xanthobacteraceae 그리고 uncultured Chitinophagaceae는 비흡연구역 C에서만 발견되었다. 흡연장에서만 발견되었던 Vicinamibacteraceae는 카드뮴을 포함한 다양한 중금속에 저항성을 가지고 있다고 연구되었으며, 카드뮴 농도가 증가함에 따라 토양 속에서 상대적으로 비율이 높아지고, heavy metal resistance genes (HRGs)와 integration gene (intlI)을 생산하고 토양에 축적하여 중금속 오염에 대한 저항성을 증가시킨다[35]. 또한 흡연장 A에서만 발견되었던 Flavobacterium, Flavisolibacter 역시 다른 균주에 비해 카드뮴을 포함한 중금속의 높은 농도 환경에서 생존 가능한 것으로 연구된 바 있다[36,37]. 특히 흡연장 A에서만 발견되었던 Nocardioides는 토양 속에서 카드뮴을 포함한 다양한 중금속을 불용화하여 침전시킴으로서, 토양 정화를 할 수 있는 미생물로 알려져 있다[38,39]. 이러한 미생물은 세포벽에 PO43-, OH-, S2-, CO2- 그리고 SO42-등을 함유하는 지질, 단백질 그리고 탄수화물로 구성되어 있고, 이는 쉽게 용해되는 Cd2+와 CdCl2를 잘 용해되지 않고, 독성이 없는 CdS 입자로 생변환하여 침전시켜 토양속 카드뮴 오염의 중화를 유도하는 것으로 알려진 바 있다[40]. 비흡연구역에서 우세하게 나타난 uncultured Vicinamibacterales의 경우 중금속 농도에 따라 생장 저해를 받는 것으로 연구된 바 있다[41]. 또한 비흡연구역에서만 발견된 uncultured Planctomycetales, uncultured Xanthobacteraceae는 카드뮴을 포함한 중금속 농도에 민감하여 중금속 저항성이 떨어지는 것으로 알려져 있다[42,43]. 흡연장 A와 비흡연구역 C에서의 근권부 토양의 카드뮴 농도가 크게 차이나지 않는 이유는, 흡연장 A에서 우세하게 발견되거나, 흡연장 A에서만 발견된 Candidatus Udaeobacter, Vicinamibacteraceae, Flavobacterium, Flavisolibacter 그리고 Nocardioides 등의 미생물들이 상대적으로 카드뮴 농도가 높은 환경에서 생존할 수 있으며, 카드뮴을 불용화 시키거나, 식물로의 흡수를 촉진시켜, 카드뮴의 농도가 일반 토양수준으로 감소된 것으로 생각할 수 있다[44]. 또한 흡연구역 A에서 uncultured Planctomycetales, uncultured Xanthobacteraceae가 발견되지 않은 것은 이들은 중금속 오염 환경에서 생장 저해를 받는 미생물로 흡연장에서 생존할 수 없기 때문이다. 이와 반대로 비흡연구역 C에서 uncultured Vicinamibacterales, uncultured Planctomycetales, uncultured Xanthobacteraceae가 우세하게 또는 유일하게 나타난 것으로 보아 흡연으로 인한 중금속이 발생, 축적되지 않는 비흡연구역 C의 근권부에서 생장 저해를 받지 않은 것으로 생각된다. 이러한 미생물 군집의 다양성 차이는 흡연장과 비흡연구역의 지리적 특성, 면적, 고도, 등 다양한 환경적 요인에 의한 영향도 있을 수 있으나, 상기 결과의 미생물 특성을 고려하였을 때 흡연 행위에 따른 담뱃재, 담배연기, 침, 카드뮴 등의 다양한 오염원과 방문자 수의 차이에 의한 미생물의 생장 조건 차이에 의해 영향을 받은 것으로 판단된다.
Metagenomical taxonomic classification and visualization charts of bacterial genera: rhizosphere samples from smoking area A and non-smoking area C.
4. 결론
본 연구를 통하여, 식물의 존재가 흡연장에서 주변 환경에 미치는 영향을 카드뮴과 토양 미생물 분석으로 중심으로 확인하였다.
1) 흡연자는 1회 흡연 중 5회 이상 침을 뱉는 것으로 나타났으며, 이 침 뱉는 행위와 흡연 중 생성되는 담뱃재 및 연기가 주변 환경을 오염시킬 수 있는 것으로 나타났다. 흡연장 각종 환경요소내의 카드뮴 농도를 ICP-MS로 측정한 결과, 식물이 있는 흡연장의 표층토의 경우 식물이 없는 흡연장의 표층토과 식물이 있는 비흡연구역에 비해 카드뮴 농도가 낮게 측정되었다. 식물이 있는 흡연장의 표층토의 경우 카드뮴 농도가 87.53 ± 5.68 µg/kg로, 식물이 없는 흡연장의 표층토의 경우 295.77 ± 16.64 µg/kg로, 식물이 있는 비흡연구역의 표층토의 경우 91.14 ± 6.17 µg/kg로 측정되었다. 식물의 존재와 흡연 유무에 따라 표층토의 카드뮴 농도가 차이가 나는 이유는, 흡연 시 발생하는 담배연기와 담뱃재에는 카드뮴이 함유되어 있으며, 식물은 뿌리를 통해 중금속을 흡수할 수 있고, 식물 근권부에 존재하는 다양한 미생물에 의해 제거될 수 있는 것으로 판단된다. 또한 식물이 있는 흡연장의 잎의 경우 식물이 있는 비흡연구역의 잎에 비해 카드뮴 농도가 높게 측정되었다. 식물이 있는 흡연장의 잎의 경우 347.117 ± 24.542 µg/kg로, 식물이 있는 비흡연구역의 잎의 경우 26.14 ± 8.40 µg/kg로 측정되었다. 흡연 유무에 따라 잎의 카드뮴 농도가 차이가 나는 이유는, 흡연 시 발생하는 담배연기 속 카드뮴을 식물 잎의 왁스층을 통해 흡착할 수 있으며, 잎 기공, 미세 균열, ectodesmata 등을 통해 흡수될 수 있는 것으로 판단된다. 또한 뿌리로 흡수한 카드뮴은 식물 체내 물관부를 통해 이동할 수 있다고 연구된 바 있다. 이러한 결과를 통해 흡연장에서 발생하는 카드뮴의 확산을 식물의 다양한 경로를 통해 방지할 수 있다고 판단된다.
2) DGGE의 경우, 흡연장 A 와 비흡연구역 C의 토양에서 20개 이상의 DNA band가 확인되었으며, 흡연 유무와 식물의 유무에 따라 토양 속 미생물 분포의 차이가 나타남을 확인하였다. 이는 흡연 중 발생하는 담뱃재 속 중금속과, 흡연 시 침을 뱉는 행위로 인해 흡연장과 A, B와 비흡연구역 C의 토양에서 미생물의 군집 차이가 발생한 것으로 판단된다. 또한 잎을 통한 중금속 흡수 과정에서 식물 체내에서 다양한 대사과정이 일어나며, 식물은 근권부 미생물과 서로 상호작용을 하는 점에서 미생물 종류에 영향을 미쳤을 것으로 판단된다.
3) 16s rRNA amplicon sequencing 기반 metagenomics 분석의 경우, 흡연장과 비흡연구역에서 미생물 군집의 다양성 차이가 genus(속)에서 발생하는 것을 확인하였다. 이는 토양 속에는 다양한 미생물이 존재하며, 미생물은 주변 환경에 대한 생장 조건이 다양하다. 다양한 조건이 있을 수 있겠지만, 흡연 중 침을 뱉는 행위에 따른 구강 미생물의 차이와, 흡연 중 발생하는 카드뮴을 포함한 다양한 중금속에 대한 미생물의 내성을 가지는 정도의 차이가 존재한다. 따라서 흡연에 따른 카드뮴 발생과 침 속 다양한 미생물로 인해 미생물 군집의 변화가 발생하였을 것으로 판단된다.
4) 근권부 토양, 표층토, 잎 속 카드뮴 농도를 분석하여 식물 체내에 카드뮴이 축적, 흡수될 수 있음을 확인하였고, DGGE 기법을 통해 흡연장과 비흡연구역에서 흡연 행위에 따라 근권부 미생물의 분포가 변화함을 분석하였으며, 16s rRNA amplicon sequencing을 이용한 metagenomics 분석을 통하여 흡연장과 비흡연구역에서 미생물 군집의 비율을 확인하였고, 이는 흡연 중 뱉는 침과, 흡연 중 발생하는 담뱃재, 담배꽁초 그리고 담배연기 속 카드뮴을 포함한 다양한 중금속에 의해 미생물 분포에 영향을 준 것으로 판단하였다. 본 연구의 결과, 흡연장에 대한 식물 식재는, 흡연으로 발생하는 카드뮴 등 각종 오염물질의 주변 환경에 대한 확산 방지에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 또한 흡연장에 대한 다양한 식물 식재를 통하여 대기 분야를 포함하는 더욱 구체적인 공중 보건 및 위생향상에 도움을 줄 수 있는 추가적인 연구가 필요하다고 판단된다.
Acknowledgements
본 연구는 산림청의 산림기반 사회문제해결 실증기술개발(R&D) 사업(과제번호: 2022431B10-2224-0802)과, 농촌진흥청의 농업정책지원기술개발사업(과제번호: PJ016185022022) 및 2022학년도 건국대학교의 연구년교원 지원에 의하여 연구되었습니다. 이에 감사드립니다.
Notes
Declaration of Competing Interest
The authors declare that they have no known competing financial interests or personal relationships that could have appeared to influence the work reported in this paper.