본 연구에서는 phosphate buffer saline (PBS) tablet (Sigma, USA), Luria-Bertani (LB) broth (Becton, Dickinson and Company, USA) 등을 사용하여 시료의 채취 및 배양을 진행하였으며, DNA extraction kit (Da BeadTM Genomic DNA Prep Kit, Biofact, Korea), gel extraction kit (QIAquick^® Gel Extraction Kit (50), Quagen, Germany)등의 시약을 사용하여 접촉식 기기의 표면 미생물의 분자생물학적 분석을 진행하였다.

세균의 CFU 측정 및 동정을 위한 시료는 서울 광진구에 위치한 10개의 건물 내 10대의 승강기 버튼, 32대의 현금인출기, 그리고 학생 및 교직원이 사용하고 있는 41개의 스마트폰을 대상으로 하여 2018년 8월부터 2019년 4월까지 일주일에 한 번씩 동일한 시간(오후 3시)에 시료를 채취하였다. 모든 실험은 시료 채취용 해당 1 기기 당 3곳의 다른 위치에서 채취하여 실험을 진행하여 표면적당 CFU 평균값을 계산하였다. 시료 채취에 사용된 사각 틀은 필터 페이퍼(Whatman^® Filter Papers No.2, UK (England))를 2×2 cm의 정사각형 모양으로 잘라낸 후, 중앙을 1×1 cm의 정사각형 형태로 오려내어 증기 멸균한 후 사용되었다. 사각 틀을 이용한 시료 채취에 있어서는 각각의 기기에서 시료를 채취하고자 하는 기기 표면에 사각 틀을 위치시키고 틀 내부의 1×1 cm가 되는 표면 전체를 증기 멸균한 면봉으로 10회 문질러 채취하였다(Fig. 1). 채취 후 면봉과 손이 접촉된 부분을 제거한 후, PBS 1 mL (pH 7.0±0.2)가 담긴 1.5 mL eppendorf tube에 넣어 실험실로 운반하였다. 모든 분석은 1시간 이내에 채취된 시료를 사용하였으며, 분석하기 전, voltex mixer를 사용하여 강하게 혼합하였다[6,7].

채취한 시료의 세균 CFU 측정을 위한 실험에서는 LB agar (Luria-Bertani broth 2.5%, agar 1.5%, pH 7.0±0.2)를 사용하였으며, 채취한 시료 20 µL를 도말한 후, 37℃에서 48시간 동안 배양하였다[8]. 배양 후에 생겨난 독립적인 집락을 계수하여 표면적당 CFU/cm²를 결정하였다.

시료를 도말한 배지를 48시간 배양한 후에 색상, 형태 등을 육안으로 구분하여 단일콜로니를 분리하였고, 분리된 미생물은 새로운 LB agar에 획선 도말한 후 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 이때 생성된 콜로니를 확인하여 단일콜로니를 재분리 후, 이를 사용하여 미생물 동정을 진행하였다. 각각의 분리된 콜로니의 16S rRNA sequencing은 대전 소재 Biofact Co.(Korea) 에 의뢰하여 분석하였다. 승강기 버튼, 현금인출기, 스마트폰 시료 중 콜로니가 가장 많이 생성된 각 2종의 시료를 사용하여 DGGE 분석을 실시하였다.

위에서 선택한 시료의 DNA는 상기 extraction kit를 사용하여 추출하였으며, 16S rRNA gene은 다음과 같은 primer를 이용해 1차 PCR (polymerase chain reaction)을 진행하여 증폭하였다: E27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'), 1542R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') [9]. 1차 PCR은 Thermal cycler (Hush Run^TM, TC-96/G/H(b)C, Biofact, Korea)를 사용하여 94℃에서 20초(denaturation), 62℃에서 40초(annealing), 72℃에서 1분 30초(polymerization)간 30 cycle을 반복하여 반응시키는 조건으로 수행하였다.

이후 1500bp size의 밴드를 gel extraction kit를 사용하여 밴드 내 DNA를 추출하였으며, 추출된 DNA를 다음과 같은 primer를 이용해 2차 PCR을 진행하여 증폭하였다: E341F-GC(5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3') [10], 785R(5'-CTACCAGGGTATCTAATC-3') [11]. 2차 PCR은 1차 PCR과 동일한 기기를 사용하여 진행하였으며 95℃에서 20초(denaturation), 65℃-55℃ (-0.5℃/cycle)간 40초(annealing), 72℃에서 1분(polymerization)간 20cycle을 반복한 후, 95℃에서 20초(denaturation), 55℃에서 40초(annealing), 72℃에서 1분(polymerization)간 15cycle을 반복하여 반응시켰다.

2차 PCR이 완료된 후에는 10% (w/v) 폴리아크릴아마이드(37.5:1 acrylamide:bisacrylamide)를 포함하는 DGGE 겔을 사용하여 DGGE를 진행하였다. 겔 제작 시 유레아(Urea, Sigma, USA)와 포름아마이드(Formamide, ReagentPlus^®, ≥99.0% (GC), Sigma, USA)로 Variable flow mini-pump (MPP-100-220, C.B.S. Scientific Company, Inc.)를 이용하여 40-70% 농도구배를 주었고 50×TAE (Tris/acetic acid/EDTA, Bio-Rad, USA)를 1차 증류수로 50배 희석하여 사용하였다. 110 volt에서 20시간동안 겔을 이동시켰으며 이 때 사용한 겔의 조성표는 Table 1에 표기하였다.

20시간 후, 1차 증류수 1 L에 브로민화 에티듐(EtBr, Sigma, USA) 120 µL을 희석시킨 용액에 15분간 staining 후, 1차 증류수에서 7분간 destaining하여 UV transilluminator (MUV26-312, Major science, USA)를 이용해 밴드를 관찰하였다.

총 140개의 승강기버튼 표면을 2018년 8월부터 2019년 4월까지 각 버튼 당 3회 씩 증기 멸균한 면봉을 사용하여 세균 시료를 채취하고 이 시료의 배양 가능한 세균의 CFU를 측정한 결과, 승강기 버튼에서는 1 cm² 당 163±17 CFU의 세균이 검출되었다. 같은 기간에 같은 방법으로 32대 현금인출기의 화면 표면 1 cm²에 존재하는 세균수는 평균 6±1 CFU였다. 또한 41개의 스마트폰 화면에서는 평균 66±13 CFU가 검출되었다(Fig. 2). 승강기 버튼, 현금인출기, 및 스마트폰 등 본 실험에서 시료를 채취하는데 사용된 모든 기기에서 세균이 검출되었으며, 시료를 채취한 기기 중 승강기 버튼에서 표면적당 CFU 값이 가장 높게 나타났다. 그러나 승강기 표면의 세균 수는 8-9월(CFU: 169±26), 1-2월(CFU: 168±37), 3-4월(CFU: 152±34)에 걸쳐 큰 변화가 관찰되지 않았다(Fig. 2). 현금인출기의 경우는 승강기 버튼과 달리 상대적으로 낮은 수의 CFU가 검출되었으며, 8-9월보다는 1-2월과 3-4월에 상대적으로 낮은 수의 CFU가 검출되었다. 스마트폰 표면의 경우 8-9월에 가장 높은 수의 CFU가 검출되었으며, 이는 계절적 요인으로 인하여 상대적으로 많이 발생한 사용자의 땀이 스마트폰 표면에 묻어 습한 환경을 제공함으로써 세균수를 높게 유지시키는 것으로 보인다[12]. 본 실험 결과에서 승강기 버튼의 표면보다 스마트폰의 표면에서 낮은 수의 CFU가 확인된 이유는 개인이 사용하는 스마트폰의 경우 수시로 표면을 세척하는 경우가 많기 때문인 것으로 판단되며, 승강기 버튼의 경우 거의 세척 또는 청소가 이루어지지 않기 때문인 것으로 보인다. 또한 한 연구에서는 표면이 거칠수록 표면적이 증가하게 되고 액체와 표면간의 친화성(affinity)이 증가한다고 보고하고 있는데, 습한 환경은 상기와 같이 세균수를 높게 유지시킬 수 있는 원인이 될 수 있기 때문에 승강기 버튼의 표면은 다른 접촉 작동식 기기들과 달리 층수가 새겨진 각인이나 점자 표시와 같이 굴곡진 부분이 있다는 점, 그리고 승강기 버튼의 표면 소재가 금속이기 때문에 현금인출기의 화면이나 스마트폰의 스크린부분보다 비교적 거친 재질이라는 점을 고려하여 CFU가 다른 접촉 작동식 기기보다 높은 수치를 기록한 것으로 기록될 가능성도 있을 것으로 판단된다[12,13]. 채집한 승강기 버튼 시료를 층별로 분석한 결과, 지하 1층 버튼과 열림, 그리고 1층 버튼에서 평균대비 높은 CFU가 측정되었다(Fig. 3). 이와 같은 CFU의 차이는 각 버튼의 사용 빈도에 영향이 있는 것으로 보인다.

시료에서의 세균 분리, CFU 측정을 위하여 고체배지를 이용한 평판배양법이 일반적인 방법으로 사용되고 있으나, 세균의 종류에 따른 다양한 영양요구성, 배양조건 그리고 배양시간 등의 각종 생육조건을 모두 충족시킬 수 없기 때문에 시료 내의 모든 세균종의 분리 및 배양이 불가능하다는 문제점이 있다. DGGE 방법은 PCR을 통해 증폭된 DNA를 이용하여 균종의 다양성을 고체배지 배양 방법보다 더 정밀하게 확인할 수 있는 방법으로써, 일반적인 배지를 사용한 배양을 통해서는 확인될 수 없는 세균의 종류 확인이 가능한 방법이다. 그러나 시료상의 DGGE의 경우 시료의 우점종을 중심으로 분석되는 경우가 많기 때문에 시료상의 모든 세균종을 분석하는 방법은 아니다. 다만 본 실험에서는 고체배지 배양방법의 한계를 보완하기 위하여 DGGE를 진행하였다[34].

승강기 버튼, 현금인출기 표면 및 스마트폰 표면 기기에서 채취한 시료를 평판 배지에서 증식시켰을 때, 각 기기 당 형태적으로 가장 다양한 종류의 콜로니가 검출된 2개의 시료를 채택하고 이를 DGGE 분석 시료로 사용하였다. 시료의 genomic DNA를 DNA extract kit를 이용하여 추출하고, 1차 PCR과 2차 PCR 과정을 통해 DNA를 증폭시켜 16S rDNA-PCR 산물의 DGGE를 수행하였다. 분석 결과, Fig. 8과 같은 DGGE fingerprint를 얻었다.

승강기 버튼, 현금인출기, 스마트폰 시료에서 가장 다양한 콜로니 형태를 갖는 시료 각 2종을 선정하여 DGGE를 시행하고 그 결과를 확인하였을 때, 평판 배양에서 발생하는 세균 콜로니 대비, 대단히 많은 수의 band가 나타났다. 또한 6종의 시료에서 공통적으로 같은 위치에 존재하는 것으로 추정되는 band가 다수 보이는 반면, 각 샘플마다 갖는 독자적인 band도 존재하였다. DGGE 상의 band가 다양하게 확인되는 것은 다양한 세균종 또는 동일 세균종 내의 다른 아종(substrain)이 존재하는 것을 나타낸다[34]. 현금인출기 화면의 시료는 하나의 고체배지에서 상대적으로 적은 종류의 세균(최대 6종)이 분리되었으나 DGGE 결과, 세 종류의 시료 중 가장 다양한 사이즈의 band (20개 이상)가 확인되어 고체배지 배양법에 의해 분리된 세균의 수와 DGGE를 통해 확인한 band의 개수의 차이가 세 종류의 접촉 작동식 기기 중 가장 큰 것으로 나타났다. 이는 본 실험에서 사용한 CFU 측정용 배지가 현금인출기 표면에 존재하는 다양한 세균류의 배양에 적당하지 않음을 나타내고 있으며, 일반적인 세균 배양용 배지를 사용한 특정 시료의 CFU 확인에 어려움이 있음을 나타내고 있다. 또한 주기적인 세척이 이루어진다고 하더라도 현금인출기 화면 모서리 부분은 청소 및 세척 작업이 제대로 이루어지지 않아 시료 채취 작업 당시 체모 및 먼지 등이 다수 발견되었다. 그러나 현금인출기 화면의 중앙 부분에서는 상기대로 주기적인 세척에 의해 매우 낮은 CFU가 검출되어 현금인출기 화면의 평균 CFU 또한 낮게 기록되었으나, 도말 및 배양 결과, 콜로니의 수가 가장 많았던 현금인출기 화면 모서리 부분에 해당하는 시료로 DGGE를 진행하였을 때, 매우 다양한 위치에서 band가 분리되었다.

승강기 버튼의 경우, 한 버튼 시료에서 분리된 세균은 최대 7종이였으나 DGGE에서는 17개 이상의 band가 분리되어 나타났다. 스마트폰에서는 한 시료에서 최대 8종의 세균이 분리되었으나 DGGE에서는 18개 이상의 band가 나타났다. 세 종류의 접촉 작동식 기기 모두 고체배지에서 분리된 세균의 종류보다 더 많은 종류의 band가 나타났으며 이는 고체배지에서 분리 및 동정되었던 미생물보다 더 다양한 종 및 아종의 세균이 기기의 표면에 존재함을 의미한다. 따라서 이들에 대한 분리 및 동정 등 추가적인 연구가 진행 된다면 공공 위생 증진 및 쾌적한 생활환경 조성에 중요한 지표를 제공할 것으로 판단된다.